2021年1月，ISO更新了关于样品制备和参照材料的10993-12标准。ISO 10993-12的主要变化包括与ISO 10993-18(器械材料的化学表征)中的定义相统一，并对包括极限浸提在内的浸提程序进行了更详细的解释。样品制备过程中最值得注意的变化是，医疗器械的非患者接触部分现在应该被物理地排除在浸提之外，或者非患者接触部分的表面积应该从浸提率的计算中排除。
另一个重要变化是强调由不同组织暴露时间的部件组成的器械。具有不同组织暴露的部件应分别浸提和测试。对于组织暴露时间超过24小时的器械，建议浸提时间为72小时，包括专门用于细胞毒性测试。较短的浸提时间(如24小时)可能不足以获得包括较长时间暴露后释放的化学物质的浸提物。
最后，新指南更新了参照材料(RM)的选项(如阳性和阴性对照)。实验室有责任选择适当的RM，并使其符合适用的生物反应的要求。
样品制备参数
更新的主要重点是将用于生物学测试的样品制备建议与用于化学表征的样品制备建议明确分开(后者在ISO 10993-18:2020中描述)。因此，ISO 10993-12:2021现在明确指出，它主要是根据ISO 10993系列的一个或多个部分，为在生物学测试系统中进行医疗器械测试的样品制备和参照材料的选择定义了要求和提供了指导。
第10.3.1节中建议的样品制备参数基本没有变化。唯一增加的是强调在细胞毒性试验中主要使用有限接触器械的条件[(37±1)℃，(24±2)小时]。还进一步澄清了浸提长时间/长期接触的器械的问题。它指出，对于这些类型的医疗器械，"建议细胞毒性测试的浸提时间为72小时，因为24小时的浸提可能不足以获得代表器械使用24小时后释放的化学物质的浸提液。然而，如果有关于长时间或长期接触组织的器械的数据，证明24小时的浸提足以释放器械中的可浸提物/可沥滤物，并且将浸提时间延长到72小时不会导致器械中释放更多的化学物质，那么24小时的浸提就足够了(extraction times of 72 h are recommended for cytotoxicity testing because extraction for 24 h may not be sufficient to obtain an extract that represents the chemicals released beyond 24 h of device use. However, if there are data available for the prolonged or long-term tissue-contacting devices which demonstrate that 24 h extraction is sufficient to release extractables/leachables from the device and extending the extraction time to 72 h does not result in release of additional chemicals from the device, the 24 h extraction is sufficient)。"
虽然建议的样品制备条件没有重大变化或修订，但确实感觉到标准的意图有了转变。这一转变是为了鼓励制造商考虑被评估的具体器械，在使用的材料方面什么是合理的，以及在生物学测试设置中应考虑的相关临床使用条件。这来自于这样一个事实，即医疗器械本身以及它们所使用的材料正变得越来越复杂，所以标准的评估方法可能不相关或不可行。通常用于生物学测试的浸提的主要目的是为了获得一个测试样本，预计至少与临床使用的条件一样具有侵蚀性。
例如，新的ISO 10993-12:2021强调，通常建议使用极性和非极性浸提工具进行浸提。然而，"在某些器械的特定情况下，只用一种浸提工具进行浸提可能是合适的，无论是极性的还是非极性的 (in some device specific circumstances, it may be appropriate to extract in only one extraction vehicle, either polar or non-polar 10.3.5 )"，例如，只预装了生理盐水的注射器将只与生理盐水/极性溶剂接触，没有其他液体。此外，还包括一个关于溶剂兼容性的声明，以强调："选定的溶剂不应损害(例如，严重肿胀、微粒生成和降解)医疗材料或器械。(Selected solvents should not compromise (e.g., severe swelling, particulate generation and degradation) the medical material or devices 10.3.10)"
复杂材料
此外，关于如何处理可吸收材料和含有此类材料的医疗器械的额外指导，现在也包括在更新的标准中。它提供了一些在测试这些类型的器械时需要的额外考虑，如定义适当的温度(基于材料的热属性和相关的临床使用条件)，在浸提过程中对pH值或渗透压的潜在影响等。该指南明确指出："对于这些材料，基于10.3制备的浸提物可能会出现渗透压或pH值的变化，而这些变化可能不适合于测试系统。在生物相容性测试之前对浸提物进行的任何调整都应该是合理的(For these materials, the extracts prepared based on 10.3 may have changes either in osmolarities or in the pH that may not be appropriate for the test system to be dosed. Any adjustment applied to the extracts prior to biocompatibility testing should be justified)" 。提供了具体指导文件的参考，如ISO 10993-3(遗传毒性)、ISO 10993-6(植入)、ISO 10993-13(可降解聚合物)、ISO 10993-14(可降解陶瓷)、ISO 10993-15(可降解金属和合金)、ISO 10993-18(化学表征)和ISO/TS 37137-1(可吸收医疗器械)。它还建议，"对于有可能存在有毒降解物和残留物的可吸收材料，应考虑对中间产品进行测试 (For absorbable materials that could potentially have toxic degradants and residuals, testing of intermediate products should be considered )"。或者，如果有理由的话，对器械进行完全溶解也是合适的;但是，"应谨慎行事，因为器械完全溶解会给后续的生物学测试带来挑战(例如，如果粘度增加，难以用完整的测试浸提物对动物进行加料，在渗透压增加或pH值变化的情况下，难以解释体外细胞测试失败数据)(caution should be taken since complete device dissolution can create challenges for subsequent biological testing (e.g., difficulty in dosing animals with neat test extract if viscosity is increased, difficulty in interpreting in vitro cell-based test failure data in case of increased osmolality or pH change))。" 标准还指出，如果对可吸收装置进行测试，并且 "如果产生的溶液包含材料的所有成分，则不需要第二个载体 (if the resulting solution contains all the constituents of the material, a second vehicle would not be needed.)"。同样，还为原位聚合材料提供了额外的指导，用于制备代表预期临床使用条件的测试样品，以提供关于固化过程中聚合物中反应成分的潜在毒性的信息。标准中提到了纳米颗粒和ISO 10993-22;然而，由于它们的性质各不相同，在ISO 10993-12中除了提到应参考标准(ISO 10993-22)以获得更多信息外，没有包含更多具体信息。
样品准备
样品准备步骤的其他关键部分是要使用的浸提比率，以及在测试样品的表面积计算中具体可以和应该包括什么。如果可能的话，测试样品中应该只包括与患者/用户接触的部分。该标准强调，"如果可能的话，医疗器械的非患者接触部分应从测试样品的浸提中排除，或者在计算浸提率时排除表面积 (Non-patient contacting portions of the medical device should, if possible, be excluded either physically from test sample extracts or by exclusion of the surface area in the calculation of the extraction ratio)。" 从之前的标准修订中可以看出，在确定样品制备的浸提率时，表面积仍然是优于样品重量的参数，除非表面积无法定义，或者基于重量的方法被证明是较差(worse case)的情况。另外，我们在样品制备过程中面临的另一个典型问题是，当一个器械有各种不同厚度的部件时。在这种情况下，是使用标准的3 cm2/mL还是更严格的6 cm2/mL更合适?ISO 10993-12中的表1现在建议，如果医疗器械包括多个厚度不同的组织接触部件，解决这个问题的方法是根据该部件最薄的材料层来确定比率，这将是最坏的情况。
参照材料（reference material， RM）的更新
新的指南更新了关于参照材料(阳性和阴性对照)的选项。现在，实验室可以根据自己的方便来选择参照材料，并对参照材料进行生物学方面的鉴定。
总之，新版本的变化并不全面，但是，在进行生物先测试之前，始终需要与监管机构进行协商，以确保测试被监管机构接受。
